Utilizada com fins medicinais pelos aborígenes por vários milênios, o óleo de Melaleuca alternifolia (OM) é um composto retirado de folhas de um arbusto chamado de “árvore do chá”, amplamente conhecida por possuir propriedades antimicrobianas, anti-inflamatórias, e analgésicas. O OM é composto por mais de 100 diferentes substâncias, porém o terpinen-4-ol é o principal componente do OM e está relacionado com as atividades antibacterianas e antifúngicas.

Nas indústrias de cosméticos, o OM é utilizado como um conservante, antisséptico ou desinfetante pela sua grande capacidade de retardar ou inibir o crescimento dos microrganismos. Tendo em vista o odor característico do OM, atualmente ele também é comercializado na forma desodorizada, porém não existem relatos na literatura da atividade antimicrobiana do óleo nesta forma. Também não há descrito na literatura a atividade antimicrobiana de nanopartículas lipofílicas contendo OM. O objetivo deste trabalho foi determinar a atividade antimicrobiana do óleo de melaleuca convencional e na forma desodorizada, assim como das nanopartículas lipoficlicas produzidas com o OM convencional. A atividade antimicrobiana foi realizada através da técnica de microdiluição em placas de 96 poços. O óleo de melaleuca convencional e as nanopartículas com este mesmo óleo foram ativos contra os microrganismos Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Listeria monocytogenes, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Candida krusei, Staphylococcus saprophyticus, Paenibacillus larvae e Paenibacillus borealis em concentrações que variaram de 0,09 a 1,5%. O óleo desodorizado quando testado contra os mesmos microrganismos não apresentou atividade antimicrobiana, ou seja, não foi capaz de inibir o crescimento de nenhum microrganismo testado. Tal achado é de grande relevância, pois o óleo desodorizado é tido como um substituto do óleo convencional, sendo considerado erroneamente com atividade antimicrobiana idêntica ao óleo convencional. Também ressalta-se que a encapsulação do OM não alterou sua atividade antimicrobiana.

1. Introdução

Tanto a farmacopéia, quanto a ISO4730 exigem que o TTO [C1] deva ser obtido por destilação a vapor e deve apresentar um teor mínimo de 30% de terpinen-4-ol e um teor máximo de 15% de 1,8-cineol. O TTO é formado por 100 diferentes compostos, porém o terpinen-4-ol é o componente principal do TTO e está intimamente relacionado com as atividades antibacterianas e antifúngicas (COX, MANN e MARKHAM 2001).

Atualmente, vários produtos de higiene  que contém o TTO são comercializados, sendo amplamente utilizado para tratamentos dermatológicos, orais, vaginais e nas infecções das vias áreas. Nas indústrias de alimentos, cosméticos e perfumarias o TTO é utilizado como um conservante, pela sua grande capacidade de retardar ou inibir o crescimento dos microrganismos (HAMILTON-MILLER, 2003). O TTO também é frequentemente utilizado em produtos antissépticos e desinfetantes (CARSON et al, 2006).

Em um processo infeccioso, os microrganismos passam por distintas fases de crescimento. Em casos de infecções crônicas ou quando o acesso nutricional é limitado, os microrganismos podem permanecer na fase estacionária, o que dificulta o tratamento. Pesquisas observaram que o TTO tem a capacidade de eliminar microrganismos em fase estacionária podendo, em alguns casos, ser utilizado como um auxiliar no tratamento a base de fármacos antimicrobianos sintéticos (PSALTS et al., 2007; KANIA et al., 2008). Outros trabalhos mostram que o TTO também pode ser utilizado na indústria de alimentos, na qual há uma grande preocupação com a formação de biofilmes, especialmente causados por Staphylococcus aureus, um microrganismo potencialmente infeccioso.

A utilização do TTO como agente antifúngico se mostra uma alternativa econômica, eficaz e segura (ROBERTS, 1999). Pesquisas realizadas por Benger, 2004 demonstraram a atividade antifúngica do TTO frente a Trichophyton rubrum, agente etiológico da onicomicose. Tal trabalho revelou que o TTO apresenta baixa concentração inibitória (CIM) contra T. rubrum (0,1%) (v/v) ao fim de sete de incubação a 25°C.

Mondello e colaboradores (2006) realizaram uma pesquisa determinando a ação in vivo e in vitro do Terpinen-4-ol e 1,8-cineol contra Candida albicans. Através do método de microdiluição em placa de 96 poços, se determinou a CIM dos compostos. O óleo de TTO se mostrou efetivo no tratamento de infecções vaginais experimentais em ratas (DE BERNARDIS, LORENZNI e CASSARONE, 1999). Após a inoculação por via intra-vaginal de C. albicans, foi realizado o tratamento com Terpinen-4-ol e 1,8-cineol. Os resultados obtidos demonstraram que o terpinen -4-ol é o provável medidor da atividade do TTO, tanto in vitro quanto in vivo e um potente agente contra a candidíase vulvo-vaginal.

Nanocosméticos referem-se a formulações cosméticas que conduzem ativos ou outros ingredientes nanoestruturados que atuarão de forma controlada, podendo modular a liberação do ativo em camadas mais profundas da pele, tornando-o mais efetivo que os produtos convencionais (POLETTO et al., 2008). Na área cosmética, geralmente, as nanopartículas apresentam diâmetros compreendidos entre 100 e 600 nm, podendo variar tanto para cima quanto para baixo desses diâmetros, dependendo do tipo de nanoestrutura utilizada (JIMÉNEZ et al., 2004; MÜLLER et al., 2002).

Algumas das vantagens que podem ser obtidas com a utilização da nanobiotecnologia na produção de nanocosméticos são: proteção das matérias-primas quanto à degradação química ou enzimática, a liberação gradual e em doses favoráveis (no caso de substâncias irritantes em altas doses), melhora na homogeneidade das formulações, o aumento da estabilidade e da eficácia dos produtos e o aumento da capacidade de oclusão da pele, devido ao tamanho nanométrico dos sistemas (FRONZA et al., 2007; MÜLLER et al., 2002; SOMASUNDARAN et al., 2007; WEISS-ANGELI et al., 2008).

Nanopartículas lipofílicas vem ganhando maior atenção nas pesquisas científicas e mercado nos últimos anos (SOUTO & MULLER, 2008). e são consideradas como carreadores nanométricos seguros, representando uma nova era tecnológica, ampliando a possibilidade do uso tópico de substâncias (PUGLIA & BONINA, 2012). Estas nanopartículas lipofílicas são produzidas sem solventes orgânicos e permitem a encapsulação de óleos essenciais e fragrâncias (SOUTO & MULLER, 2008). Entre as vantagens de encapsular este tipo de óleo volátil, destacam-se o controle da liberação, o aumento da eficácia, a estabilização do ativo e a redução dos efeitos irritantes (SOUTO & MULLER, 2008).

 2. Objetivos

Caracterizar o óleo de melaleuca convencional e desodorizado quanto à composição química e eficácia antimicrobiana. Selecionar o óleo mais adequado, produzir nanopartículas lipofílicas e realizar caracterização físico-química e microbiológica dos sistemas nanoestruturados.

3.1 Materiais

Óleo de melaleuca convencional e desodorizado foram adquiridos de distribuidoras de matérias primas, localizadas em Porto Alegre e São Paulo, Brasil. A suspensão aquosa de nanopartículas lipofílicas contendo óleo de melaleuca convencional a 7 % (Inventiva, Brasil) foi produzida através de processo próprio industrial sob sigilo e utilizada em todas as análises na forma recebida. Não foram adicionados conservantes a esta formulação de nanopartículas.

3.2 Métodos

3.2.2 Caracterização das nanopartículas

Analise dos componentes do óleo

Analise microbiológica dos óleos e nanopartículas de M. alternifolia

Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo, conforme preconizado pelo CLSI, 2010. Foi utilizado o caldo Mueller Hinton para o crescimento das estirpes. Placas de 96 poços foram utilizadas para a realização do teste. Os microrganismos foram inseridos em solução salina estéril, até atingir 0,5 na escala McFarland (equivalente a 1,5×10⁸ UFC/mL) e então foram distribuídos nos poços das placas. Em seguida, foram adicionadas diferentes concentrações dos óleos e as placas foram  incubadas a 37°C/24 horas. Após 24 horas de incubação, o resultado da CIM foi verificado. Para tal, utilizou-se o Cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazolio, que indica crescimento bacteriano.  O ensaio foi realizado em triplicata.

3.2.2.1 Determinação do diâmetro de partícula e potencial zeta

O diâmetro médio e a distribuição de tamanho das nanopartículas foram determinados através de espectroscopia de correlação de fótons, utilizando o equipamento Zetasizer^® NanoSeries (Malvern). As amostras foram diluídas 500x em água ultra pura e analisadas com índice de refração do padrão poliestireno. O potencial zeta foi determinado no mesmo equipamento, após diluição de 500x das nanopartículas em solução de NaCl 500 mM.

3.2.2.2 Determinação do pH

O pH da dispersão coloidal foi determinado através de medidas potenciométricas com pHmetro Hanna modelo pH21.

3.2.2.3 Determinação das Características organolépticas

O aspecto, a cor e o odor das amostras foram analisados durante o estudo de estabilidade do produto, a fim de verificar alterações macroscópicas, como separação de fases, precipitação e alterações visíveis de cor.

4. Resultados e Discussão

Os óleos de melaleuca (OM) adquiridos do mercado foram analisados através de cromatografia gasosa. No screening cromatográfico, foi possível observar que OM convencional apresentou uma substância majoritária na sua composição, sendo esta identificada por terpinen-4-ol (Fig. 1A). Já no OM desodorizado não foram observados picos cromatográficos característicos (Fig.1B), principalmente no tempo de retenção especificado para o terpinen-4-ol. Assim sendo, observam-se perfis cromatográficos bem diferenciados entre o OM convencional e OM desodorizado indicando a ausência, principalmente, do terpinen-4-ol no OM desodorizado. Por se tratar de uma substância volátil, pode-se presumir que o terpinen-4-ol foi retirado do óleo durante o processo de desodorização.

Figura 1- Cromatograma obtido do OM convencional (A) e OM desodorizado (B).

Os mesmos óleos foram analisados quanto a sua atividade antimicrobiana frente a diferentes cepas de bactérias e fungos. A Tabela 1 apresenta a atividade antimicrobiana dos óleos de M. alternifolia.

Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima dos óleos de melaleuca odorizados e desodorizados adquiridos no mercado.

Os dados de CIM demonstram que os óleos odorizados, mesmo de fornecedores diferentes, apresentaram mesmos valores e mesma potência antimicrobiana, tendo uma ampla ação frente a fungos e bactérias. Por outro lado, o OM desodorizado não apresentou qualquer atividade frente a nenhum dos microrganismos estudados. Estes dados corroboram com a análise cromatográfica, uma vez que já é descrito na literatura que o principal ativo do OM é o terpinin-4-ol, ausente no óleo de melaleuca desodorizado.

Assim, o OM convencional foi selecionado na produção de nanopartículas lipofílicas.

As nanopartículas apresentaram-se como suspensões brancas e opacas de baixa viscosidade e com odor característico do óleo de melaleuca. O diâmetro médio foi de 287 ± 2 nm, com índice de polidispersão de 0.203 ± 0.022. O potencial zeta foi negativo, com valor que corrobora com a estabilidade do sistema, sendo a -14.2 ± 1.7 mV. O pH da suspensão de nanopartículas foi cerca de 4.1 ± 0.2.

A Figura 2 apresenta a distribuição de tamanho de partícula da formulação e a figura 3 apresenta o potencial zeta.

Figura 2. Distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas de óleo de melaleuca.

Figura 3. Curva de potencial zeta das nanopartículas de óleo de melaleuca.

As nanopartículas contendo OM foram analisadas frente a alguns dos microrganismos inicialmente selecionados no screening dos óleos. A Tabela 2 apresenta os dados de CIM obtidos com a suspensão de nanopartículas com 7% de OM. A CIM das nanopartículas foi a mesma (1,5%) para P. larvae, porém  este valor da suspensão equivale a 0,105% do OM, uma vez que a suspensão de nanopartículas contém 7% do OM. Em relação à P. borealis, A CIM do óleo puro foi de 1,5% e da suspensão de nanopartículas foi de 6,25%, equivalendo a 0,437 % do OM puro. Estes dados demonstram o aumento de eficácia antimicrobiana do OM em relação às nanopartículas de OM, que obtiveram grande efeito antimicrobiano em baixas concentrações do óleo encapsulado.

A Tabela 2 apresenta a atividade antimicrobiana de nanopartículas de óleo de melaleuca.
* concentração inibitória mínima da suspensão de nanopartículas contendo 7% do óleo de melaleuca.

5.Conclusão

O óleo de melaleuca convencional apresentou alta concentração de terpinen-4-ol e ampla ação antimicrobiana frente a diferentes cepas de microrganismos. Por outro lado, o OM desodorizado quando testado contra os mesmos microrganismos não apresentou atividade antimicrobiana, ou seja, não foi capaz de inibir o crescimento de nenhum microrganismo testado. Isto também foi refletido na ausência do terpinen-4-ol. Tal achado é de grande relevância, pois o óleo desodorizado é tido como um substituto do óleo convencional, sendo considerado erroneamente com atividade antimicrobiana idêntica ao óleo convencional. Quanto à nanoencapsulação do OM, esta demonstrou-se viável e com sucesso, tendo diâmetro, pH e potencial zeta adequados para aplicação clínica.  A encapsulação do OM aumentou a atividade antimicrobiana do mesmo, sendo que menores concentrações do óleo foram necessárias para mesmo efeito.

Renata Platcheck Raffin^1,2*, Cândice Caroline Felippi², Kauana Pizzutti³, Camilla Filippi dos Santos Alves³, Priscila Quatrin³, Vanessa Comin³, Marcele De Leon Nunes², Ricardo Lorenzoni², Juliana Emmanuelli², Patrícia Gomes¹, Roberto Christ Vianna Santos³

 ¹Laboratório de Nanotecnologia, Programa de Pós-Graduação em Nanociências, Centro Universitário Franciscano-UNIFRA, Santa Maria, RS, Brasil
² Inventiva, Porto Alegre, RS, Brasil
³ Laboratório de Pesquisa em Microbiologia, UNIFRA, Santa Maria, RS, Brasil
*[email protected]

6.  Referências

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