Schulman, FG3; Spindola, DG 1,2; Bincoletto, C2; Oliveira, CR*1,2

1Grupo de Fitocomplexos e Sinalização Celular, Universidade Anhembi Morumbi, SP.

2Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo, SP.

3Centro de Pesquisa Vita Derm/ISIC, São Paulo, SP.

Contato: *[email protected]

1. INTRODUÇÃO

Conservantes são substâncias químicas, também conhecidas como preservantes, usualmente utilizadas em formulações cosméticas, farmacêuticas e em alimentos. Têm função de inibir o crescimento excessivo de microrganismos, a fim de manter a estabilidade dos produtos, protegendo-os contra oxidações e deteriorações indesejáveis causadas por bactérias, fungos e leveduras (BRASIL, 2001).

Entre suas propriedades eles devem ser: inodoros, incolores, insípidos. Também precisam apresentar compatibilidade química e fisiológica e ser atóxicos e solúveis. Eles são mais efetivos quando aplicados como mistura de conservantes (Zabrzewska, et al; 2014).

Através de levantamento efetuado com os fornecedores de insumos, entre os conservantes mais utilizados pela indústria cosmética estão os parabenos, o fenoxietanol, as isotiazolinonas e o caprililglicol. É sugerido que o modo de ação dos parabenos se dá pela disrupção dos processos de transporte da membrana ou pela inibição da síntese de DNA e RNA de algumas enzimas chave, como ATPases e fosfotransferases, em alguma espécies de bactérias (Valkova, 2001). O fenoxietanol age na ruptura da membrana pela solubilização de lipídios e possível desnaturação de proteínas. As isotiazolinonas atuam por meio da inibição do mecanismo de transporte ativo e oxidação de glicose nas membranas das células, pela reação com os grupos tiólicos de proteínas como o ATPase e Gliceráldeido-3-Fosfato, desnaturando-as (Eguchi, 2005). Por fim, o caprililglicol tem como ação o rompimento da membrana da célula, pois ele interage fisicamente com ela (Ziozi, P. et al, 2014).

Nos últimos anos, o uso de ensaios in vitro tem comprovado a segurança ou toxicidade dos respectivos conservantes quando aplicados em células humanas. No mercado cosmético há uma imensa variedade de escolha de conservantes, cabendo ao formulador analisar a molécula mais segura e adequada ao seu projeto.

Portanto, este trabalho tem como objetivo avaliar e comparar a citotoxicidade, através de testes in vitro, de diferentes misturas de conservantes, após exposição em linhagem de fibroblastos humanos.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Preservantes

Os preservantes químicos utilizados neste estudo foram gentilmente cedidos pela Empresa Vita Derm e todos apresentando grau analítico de pureza. Os preservantes avaliados foram denominados da seguinte maneira, a saber: (A) Fenoxietanol + Caprililglicol; (B) Fenoxietanol + Parabenos e (C) Metilcloroisotiazolinona + Metilisotiazolinona. Para composição detalhada das misturas, ver tabela 1. Outros reagentes e compostos foram adquiridos das empresas Sigma (St. Louis, MO) e BD Pharmingen (CA,USA).

2.2 Preparação das amostras

Para avaliar alterações na viabilidade celular e a capacidade dos conservantes em induzir apoptose, as células foram tratadas, in vitro, na concentração de 0,2%. Todas as amostras foram diluídas em meio de cultura e filtradas (0.22µ) antes de entrar em contato com as células.

2.3 Cultura celular (linhagem CCD1072Sk)

As células da linhagem de fibroblastos humano CCD1072Sk (ATCC® CRL2088?) foram cultivadas em meio de cultura Iscove’s modified Dulbecco’s medium (Gibco®, USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 UI/mL de penicilina/estreptomicina e 0.25 ?g/mL de Fungizona® (Gibco®, USA) em uma atmosfera umidificada a 37°C na presença de 5% CO2. As células eram tripsinizadas três vezes por semana com 0,25% tripsina/EDTA (Cultilab®, Brasil) para troca do meio de cultura. Em todos os experimentos os fibroblastos foram submetidos ao teste de viabilidade celular utilizando o corante azul de tripano e realizado a leitura em câmara hemocitométrica por microscopia óptica. Todos os experimentos descritos foram realizados quando a viabilidade celular foi igual ou superior a 95%.

2.4. Estudo da viabilidade cellular

Para avaliação da viabilidade celular, fibroblastos tratados com 0,2 % de cada mistura de preservantes (A, B e C) foram tripsinizados e ressuspendidos para a incorporação do azul de tripano. Resumidamente, após 24 horas de tratamento, o conteúdo de cada poço das placas de cultura de fibroblastos foi recolhido em tubos de 15 mL e centrifugados a 1500 rpm por 8 minutos. Os pellets foram ressuspendidos em 1 mL de meio de cultura. Em seguida, as soluções de células foram diluídas (1:1) em azul de tripano e a contagem das células foi realizada em câmara hemocitométrica por microscopia óptica. A soma da contagem de células totais (viáveis e inviáveis de cada poço) foi considerada como 100% de células, sendo realizados os cálculos para verificar as porcentagens correspondentes às células viáveis e as inviáveis analisadas no experimento.

A viabilidade celular também foi avaliada através do teste de redução do MTT (methyl-thiazol-tetrazolium), como descrito por Mosmmann, 1983. Assim, às 5×104 células/poço que foram tratadas com de 0,2% de cada mistura de preservantes (A, B e C), foram adicionados 10µL da solução de MTT 5mg/mL (Sigma-Aldrich). Após 4 horas, os cristais formados no fundo da placa foram dissolvidos adicionando aos poços 150µL da solução de SDS 10% (Dodecil sulfato de sódio) e incubados overnight. A densidade óptica foi medida pelo leitor de microplacas (FlexStation® 3 multimode benchtop reader) em 595 nm. A percentagem de sobrevivência celular na presença dos compostos em estudo foi calculada da seguinte maneira:

% Células viáveis = Absorbância por poço (tratado) x 100 / Absorbância do controle

2.5. Avaliação do ciclo celular pela incorporação do Iodeto Propídeo.

Foram realizados ensaios de incorporação do iodeto de propídio para avaliação de morte celular por citometria de fluxo (Riccardi & Nicoletti, 2006). Resumidamente, os fibroblastos foram plaqueados com os preservantes (2×105 células/poço). Após incubação de 24 horas, as células foram transferidas para microtubos onde foram realizadas sucessivas lavagens com PBS e posteriormente etanol gelado. Foi incubado com solução de RNase por 30 minutos à 37?C. Após, sob abrigo da luz, foi adicionado o iodeto de propídio (1mg/mL) e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. As células e o sobrenadante foram recolhidos e analisados utilizando o citômetro de fluxo BD FACSCalibur® (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, U.S.A.) e o software Cell Quest® (Becton-Dickinson). Os dados adquiridos foram analisados pelo software FlowJo® (Tree Star, Oregon, USA).

2.6 Análises estatísticas

Os resultados foram apresentados como média + EPM (erro padrão da média). Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguido de teste a posteriori de Tukey. Valores de P<0,05 foram considerados significativamente diferentes. As análises foram realizadas no programa GraphPad Prism versão 5.0.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Preservantes cosméticos possuem a propriedade de garantir a eficácia dos produtos, estendendo seu prazo de validade e oferecendo maior segurança para o consumidor (Rebello, 2005). Contudo, os eles não devem apresentar, principalmente, características tóxicas ou irritantes para o usuário, devido estes entrarem em contato direto com a pele e o organismo humano (Orton & Wilkinson, 2004).

Neste sentido, as possíveis alterações na viabilidade de fibroblastos humanos decorrentes da exposição aos preservantes testados foram avaliadas neste trabalho por dois métodos. O método de exclusão do azul de tripano é utilizado para a determinação do número de células viáveis em uma suspensão celular. Baseia-se no princípio de que células viáveis (com membrana celular intacta) são capazes de excluir o azul de tripano, que atravessa a membrana, do seu citosol. Enquanto células inviáveis (com membrana celular comprometida), como em estado apoptótico avançado, são incapazes de excluí-lo (Strober, 2001). De acordo com os resultados obtidos, observamos que dos preservantes testados, apenas o preservante C apresentou citotoxicidade significativa sobre a linhagem de fibroblasto utilizada neste trabalho (Figura 1).

Outro método utilizado nesse trabalho para verificação da viabilidade celular foi o teste de redução do MTT, que é usado com grande sucesso para estimar o número de células viáveis em diferentes situações. Sua interpretação serve de indicativo da atividade metabólica celular, e o local de ocorrência das reações redox inclui tanto mitocôndrias como o citosol. A redução do sal de MTT à formazan é realizada principalmente pela enzima succinato-desidrogenase, e resulta em cristais de formazan insolúveis na cor violeta. A intensidade da coloração é utilizada para medir a atividade mitocondrial e consequentemente a viabilidade celular (Mosmann, 1983).

Assim, o teste de redução do MTT, mostrou redução significativa de células viáveis quando comparadas ao controle, no entanto, o comportamento do preservante C foi semelhante ao teste de azul de tripan, mostrando-se mais citotóxico (Figura 2).

Figura 2. Efeito dos preservantes sobre a viabilidade de fibroblastos. As células foram tratadas por 24 horas com concentração de 0,2% de cada uma das três misturas de preservantes (A, B e C). A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de redução do MTT. Os dados representam a media com + desvio padrão de três experimentos independentes. (*) P<0.01; ANOVA, Tukey.

Os dois métodos utilizados para verificação da viabilidade celular apresentaram comportamento semelhante, no entanto, observamos que pelo método que utiliza o corante azul de tripan, a citotoxicidade do preservante C foi mais acentuada.

Outra ferramenta utilizada neste trabalho, com o intuito de auxiliar na avaliação da citotoxicidade dos preservantes aqui avaliados, foi a quantificação da população de células que ficam retidas na fase sub-G1 do ciclo celular. O teste de marcação com iodeto de propídio por citometria de fluxo é amplamente utilizado para a avaliação do ciclo celular em diferentes modelos experimentais (Zhao, 2010). Baseia-se no princípio de que o iodeto propídio é capaz de se incorporar ao DNA tornando possível o estudo das fases do ciclo pela quantificação de DNA. (Riccardi e Nicoletti, 2006). Deste modo, a figura 3A indica que o preservante C apresentou maior percentual de células retidas na fase sub-G1 do ciclo celular, não permitindo que estas células avançassem no ciclo. Isto pode sugerir presença de morte celular, uma vez que o estado de morte se relaciona com o aumento da percentagem das células fora do ciclo celular, considerada como fase sub-G1.

Figura 3. Efeito de preservantes sobre a população de células em fase sub-G1 do ciclo celular. Os fibroblastos foram tratados por 24 horas em uma concentração de 0,2% de cada uma das misturas de preservantes (A, B e C). (A) Percentual de células em fase sub-G1. Note aumento significativo de células que não avançaram o ciclo celular. (B) Histogramas representativos das análises realizadas após o tratamento com as três misturas de preservantes testadas. Os dados representam a media com + desvio padrão de três experimentos independentes. (*) P<0.01; ANOVA, Tukey.

Por fim, os resultados aqui obtidos, caminham no mesmo sentido vários estudos recentemente publicados e que relacionam problemas de alergia e sensibilização por contato de preservantes que apresentam os componentes aqui testados in vitro, no preservante C (Khunkhet, e Wattanakrai, 2014; Martin e Iva, 2014; Liuti, 2014; Isaksson, 2014 e Bruze, 2014).

4. CONCLUSÃO 

Com base em nossos resultados, podemos concluir que dentre os preservantes testados, o representado por C foi o que se mostrou mais citotóxico. Podemos sugerir este comportamento baseando-se nos resultados obtidos, onde o preservante apresentou menor viabilidade celular se comparado aos outros testados, além de se mostrar capaz de reter no estagio sub-G1 mais células do que os outros preservantes analisados. Dessa maneira, além da necessidade de mais estudos sobre a segurança destas substituições, é preciso realizar uma avaliação com cautela durante a escolha do preservante a ser utilizado, analisando-se a formulação como um todo; levando sempre em consideração sua correta aplicação na forma farmacêutica escolhida e analisando-se suas concentrações mínimas inibitórias, respeitando os limites estabelecidos pela legislação vigente.

5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 

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5.BRASIL. Agência nacional de vigilância sanitária. RDC nº 29, de 1 de junho de 2012 Aprova o Regulamento Técnico Mercosul sobre ?Lista de Substâncias de Ação Conservante permitidas para Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes?. Diário Oficial da União, 01.06.2012. (c)

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